L'infiltrazione superficiale
Le caratteristiche dell'area carsica di Frasassi favoriscono una naturale protezione rispetto ai fenomeni di inquinamento provenienti dall'esterno; la struttura calcarea infatti appare lateralmente bordata da coperture a bassa permeabilità che precludono la possibilità di apporti inquinanti dai centri abitati presenti sui fianchi della struttura montuosa.

Anche la presente destinazione d'uso del suolo nelle aree di assorbimento appare tranquillizzante rispetto alla tutela dell'acquifero; buona parte del rilievo presenta infatti versanti piuttosto acclivi, con boschi cedui che in diverse aree non sono neppure oggetto di sfruttamento attuale; le superfici sommitali della dorsale, in passato oggetto di coltivazione, sono state parzialmente rimboschite, mentre restano limitate superfici utilizzate per colture prative o per pascolo. Il tipo di colture, estensive, l'assenza di insediamenti stallivi e di residenze umane permanenti, il basso numero di animali periodicamente presenti, non sembrano costituire condizioni oggettivamente negative per la qualità delle acque sotterranee. La misurazione dell'andamento stagionale di temperatura e conducibilità delle acque, effettuato tramite data logger remoti sistemati nel ramo sulfureo della Grotta del Fiume evidenzia marcate variazioni imputabili alla stagionalità dei fenomeni di ricarica meteorica. I parametri controllati subiscono infatti variazioni secondo cicli stagionali, con un graduale incremento di temperatura e conducibilità durante la stagione primaverile ed estiva in conseguenza della diminuzione degli apporti meteorici nelle acque freatiche; nella stagione autunnale i più cospicui apporti di acque percolanti causano una diluizione delle acque sulfuree ed un abbassamento dei valori di conducibilità e temperatura. Si possono osservare picchi negativi nei valori misurati in occasione di forti eventi meteorici; in questi momenti il rapido afflusso di acque percolanti con contenuto salino e temperatura più bassi influenza rapidamente le caratteristiche delle acque freatiche; il sistema tende poi a recuperare rapidamente le condizioni precedenti, in seguito alla diminuzione degli apporti di acque percolanti. Questi dati evidenziano come il sistema di Frasassi sia esposto alla possibilità di una ricarica rapida da parte di acque superficiali, per quanto nella zona di trasferimento risultino pressoché assenti condotti carsici praticabili.

Contaminazione di acque fluviali
Il Fiume Sentino, il principale corso d'acqua che attraversa la zona, non presenta condizioni ecologiche particolarmente compromesse, nonostante nella parte a monte attraversi i centri urbani di Scheggia e Sassoferrato. L'importanza dei contributi di acque sotterranee nell'alimentazione di questo fiume, congiuntamente con il ridotto numero di residenti presenti nel bacino imbrifero, fanno sì che le acque del Sentino nella Gola di Frasassi possano essere considerate da non inquinate a leggermente inquinate in base degli indicatori chimici, batteriologici, e biologici (Cocchioni & Pellegrini, 1996). I rapporti tra falda idrica e fiume evidenziano una costante alimentazione del corso d'acqua da parte delle acque sotterranee nella zona a valle, mentre a monte, nella parte superiore della Gola, è stato più volte ipotizzato che le acque del Fiume Sentino si infiltrino all'interno del massiccio calcareo (Gambelli et al., 1978). Anche i recenti controlli sulle variazioni stagionali di portata nel Fiume Sentino evidenzierebbero un andamento intermittente dei rapporti tra fiume e falda, con periodi in cui il fiume nell'attraversare la Gola subisce complessivamente perdite idriche e periodi in cui al contrario riceve apporti (Caprari et al., 1998).

Allo stato attuale tuttavia le strumentazioni installate all'interno delle grotta non hanno fornito evidenze di fenomeni di miscelazione tra acque sotterranee e superficiali rilevabili strumentalmente; anche i cospicui abbassamenti di temperatura osservati nelle acque freatiche da Dragoni & Verdacchi (1993) sono chiaramente dovuti ad una errata valutazione e validazione dei dati strumentali. Nelle parti interne della grotta le osservazioni dirette portano ad escludere che si possa avere miscelazione diretta delle acque sotterranee con quelle fluviali; si ritiene pertanto che eventuali ingressioni di acque fluviali nelle gallerie carsiche possano interessare esclusivamente le zone più esterne del complesso, nelle immediate vicinanze ai punti di emergenza. Non può però essere escluso che parte delle acque del fiume Sentino nella zona a monte della Grotta possano contribuire ad alimentare la circolazione sotterranea.

La grotta turistica
La gotta turistica costituisce un altro potenziale veicolo di inquinamento delle acque sotterranee, stante la presenza di circa 300.000 persone che si fermano nel sottosuolo per un periodo di poco superiore ad un'ora. I potenziali inquinanti immessi dai visitatori sono rappresentati in prevalenza da polveri e pollini introdotti nel sottosuolo, oltre che dal calore prodotto con la presenza dell'uomo e con l'impianto di illuminazione ed alla CO2 liberata nella respirazione; tutti questi elementi rappresentano i principali problemi per la conservazione delle caratteristiche ambientali in una grotta turistica, ma la maggior parte di essi non sembra poter incidere sulla qualità delle acque sotterranee. L'elemento che può avere maggiore incidenza è rappresentato dalle acque di lavaggio, utilizzate per la pulizia interna, in particolare nei camminamenti; a quest'ultimo proposito l'impiego di ipoclorito nel lavaggio delle concrezioni ha suscitato preoccupazioni per i potenziali effetti negativi sulla vita ipogea e sulle acque sotterranee. Le modeste quantità di prodotto impiegato, la notevole diluizione con acque di lavaggio, la distanza temporale tra i successivi interventi, il parziale recupero delle stesse acque di lavaggio, la facile degradabilità dell'ipoclorito in cloruri, già abbondantemente presenti nelle acque della falda, rendono questo tipo di operazione meno preoccupante per la qualità delle acque di quanto si possa presumere. In ogni caso allo stato attuale non risultano elementi che evidenzino fenomeni di inquinamento delle acque freatiche causati dalle acque di lavaggio impiegate nella grotta.